光透过某一物质时,个别波长的光被该物质吸收,因而在连续波谱中有一段或几段波长的光减小了或消失了，这些波谱称为吸收波谱。不同物质的吸收波谱不同，这取决于物质的分子、原子和原子团，因而可用吸收波谱来分辨物质和推断样品的结构；同时吸收波谱的强弱和物质的含量有关，这个性质可拿来做定量剖析。
原理入射光(I0)经过均匀而透明的碱液时，一部份光被溶质吸收(IA)，一小部份被反射(IR),只有一部份可以透过(IT)。
I0＝IA＋IR＋IT在物理剖析中，常用一个"空白"碱液作为参考去校准反射的光，则IR可以忽视不计。
I0＝IA＋IT此处I0又可以看作为透过"空白"的光硬度,由于"空白"是不吸收任何光的。所以IT/I0是透光率(T)，常用％来表示；但在实际应用中，常常用光吸收(A)来表示。
A＝logI0／IT图a是以T来表示的吸收波谱,而图b是文献中常见的以A表示的吸收波谱,从这两个图谱可以了解到T和A的关系。
当某一物质吸收一定波长的光时，若此时A＝1，即其透过光的硬度为照射光的10％；若A＝2，表示含量大了一倍,其透过光的硬度为照射光的1％。按照贝尔定理，A＝ELC，A为光吸收，E为吸收系数，L为吸收杯光径,C为含量。在碱液含量不很大的情况下，由光在碱液中被吸收的程度A，可以决定碱液的含量C，这就是吸收波谱定量剖析的原理。
分光光度计的构造和性能分光光度计一般包括光源，分光系统和受光器等几个主要部份：
光源通常340纳米以上采用钨灯作为灯源，340纳米以下采用氢灯或氘灯作为灯源。在安装时，钨丝的位置要调节到刚好对准入光狭缝，此时灵敏度最佳。
分光系统指把混和的灯源光分散成某些光波的装置。通常是特殊玻璃或石英制的棱镜；另一种色散系统是衍射光栅。
受光器一般是光电瓶或光电倍增管。透过光的能量通常是很小的，受光器能把它转弄成电压并放大，光电流的信号和强弱再用电压计或记录仪显示或记录出来。光狭缝有两种表示方式，一种以毫米表示实际狭缝间距，另一种用波谱狭缝表示，单位是纳米。狭缝愈小，光含量愈高，但透过的光硬度也愈弱，在实际应用中要按照实验的要求加以调整。储存样品的吸收杯，在测可见光时可采用玻璃制的吸收杯，在测紫外部分时必须采用石英吸收杯。
常用的分光光度计是直接读数或零点法，也有用记录仪记录的。
应用任何物质只要它有吸收波谱，就可以拿来做定性和定量剖析。
定性剖析按照样品吸收曲线的形状，并与已知物质吸收波谱对比，可知其是否同一物质。例如生物样品中，蛋白质吸收高峰通常在280纳米,核苷酸一般吸收高峰在260纳米。氧化型辅酶Ⅰ吸收高峰在260纳米，而还原型辅酶Ⅰ在340纳米出现一个新吸收峰。几种不同的碱基，它们的250纳米／260纳米和280纳米／260纳米比值是各不相同的，可以便捷地区别开。
定量剖析①单组份定量，按照检测到的样品的光吸收值和已知的样品消光系数，可以估算出样品的量。②多组份剖析，假如样品是个混和物，其中富含两种或两种以上的吸收物质，这种物质之间不起物理反应，其吸收波谱其实相互重叠，但各自的吸收峰和峰谷是不同的，这样可以不经分离而直接用波谱法对各个组分进行定量测定。以两个组分A和B的混和物为例，选择二个波长，一个是A组分的最大吸收(憶)，另一个是B组分的最大吸收(憻)，再分别以A和B碱液在这二个波长下测出各自的消光系数(E憶A、E憶B、E憻A和E憻b),之后再用混和物在这二波长下测出光吸收A憶和A憻。因而
A憶＝E憶A·CA+E憶B·CCB
A憻＝E憻A·CA+E憻B·CB这两个式中除CA和CB是未知含量外,其余光吸收(A)和消光系数(E)均为已测知数，解这联立多项式,即可估算出含量CA和CB。③酶活性测定，当酶反应的底物或产物中有一个显著的吸收波谱时，借测这个生色络合物的出现或消失速率可以跟踪酶的反应。诸如氧化型和还原型辅酶Ⅰ的互变在340纳米处有一个吸收峰的消失或生成，这一特点常常用于测定个别酯化酶的活性。
差波谱法差示分光光度法是测二种吸收波谱之差。其优点是能检出光吸收大的系统中比较小的光吸收变化。①当被测定物质含量很大，而又不能稀释后再测定，这么测定的偏差都会很大。有些中级的分光光度计其实光吸收可以测到很高值，但也不能无限制的扩大。这些情况下可采用略高于样品含量的已知含量纯物质作为参考样品放在空白对照光径中，再进行未知样品含量的测定，致使欲测定样品的读数一直落在刻度盘读数范围内。②在研究蛋白质氢键中，蛋白质或酶在加入作用物后，波谱会形成微小的变化，而蛋白质本身含量常常较大，不容易察觉到这些微小变化。此时可在参考光径中把酶和作用物分别放在二个吸收杯中，而在检测光径中把酶和作用物置于同一个吸收杯中，而检测光径中的第二个吸收杯中仅为相应的缓冲液，这样进行波长扫描，可以清楚地观察到个别波长处的变化，并可定量。
波谱滴定滴定法中会有3个组分──滴定剂、被滴定物和生成物。只要这三个组分中任何一个组分有光吸收，且在滴定过程中光吸收会提高或减缓，则可借助波谱法测得其滴定终点，估算其含量。诸如滴定蛋白质中某个多肽残基数，可用相应的试剂，每次加入一定容积后搅拌均匀并测其光吸收。虽然每次加入试剂体积极微吸收光谱，但仍需进行容积校准得到校准后的光吸收值。以光吸收为纵座标，滴定剂量为横座标，可以得到一个波谱滴定曲线，其转折点即为滴定终点。以蛋白质量与作用试剂的物理计量之比即可估算出此多肽残基数。
在进行波谱剖析时，不仅仪器本身的性能，以及使用不妥会影响到测定结果外，还有一些诱因也会影响实验结果。例就像一样品在不同溶剂中，它的吸收峰和消光系数常常不同；在不同PH下，波谱特点和光吸收也会有所变化。个别特殊情况下（比如酶反应），气温也会影响到测定吸收光谱，都需加以注意。