1991年诺贝尔生理医学奖Neher出生于1944年,美国人1965年结业于976年在哈佛学院医大学取得医学博士学位随后常年从事基础医学研究年出生于荷兰的斯图加1963年结业于学院,仍然从事电生理学方面的研究1976年Neher和合作发明了技术,发觉了细胞膜存在离子通道,而共同获得1991年诺贝尔奖。1976年Neher和完善了膜片钳技术()。这是一种以记录通过离子通道的离子电压来反映细胞膜中单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术。之后因为吉欧姆阻抗封接(10Ω)技巧的确立和几种方式的创建,1980年以来,此技术已可用于好多细胞系的研究。•膜片钳技术的优势在于其具有0.06pA的电压检测灵敏的空间帧率及10μS的时间帧率。使我们通过该技术了解到某个顿时、特定条件,细胞膜离子私密性和膜通道蛋白构象的变化,进而使其成为目前从功能角度剖析各类生理、病理功能机制的最直接、理想的电生理学研究手段。该技术的问世,为生理学、药理学、病理生理学和分子生物学的多种学科关于生命活动规律、疾病及转归机制、药物作用机制的研究开辟了辽阔的前景。
Neher和也因其杰出的工作和贡献,获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。•在激动过程中离子联通数目之多,速率之快,使人们猜测在激动时膜结构中有特殊的蛋白质通道的存在。但因为当时技术所限,无法揭示。直到1976年Neher和首次运用一种被称为膜片钳()的新记录方式,记录膜结构上单一的离子通道的开放和关掉,导致的单通道离子电压和浊度,进而揭露了离子通道研究的新篇章。和将半径1~5μm的玻璃微电极在火上抛光,之后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧密接触。电极尖端与膜之间的接触,使尖端内的小片膜与其余部位在热学上绝缘,产生50MΩ封接,保证了电压经微电极步入检测电路。之后,Neher又作了改进,用负压轻吸微电极引起管口与膜脂类单层之间十分紧密的封接(百兆欧封接)。百兆欧封接有两个重要后果,首先,小管内和细胞外液之间的阻值高达100百兆欧姆,因而在同一钳位电流下,膜单离子通道开放和关掉造成的离子电压、电导以及通道开放的时间概率及通道的动力学特点等皆可被测定。第二,微电极尖端管口和膜之间封接的机械硬度不同细胞膜片,可以形成几种不同的记录方法。
不同的记录方法可拿来研究私密性的不同方面。微电极尖端管口所围绕的细胞膜就是要观察离子通道变化的“膜片”,假如在这一小片膜上只富含一个或少数几个通道蛋白分子,则可通过离子通道浊度的特性,测定出单一通道开放时的离子电压,因而对单通道的功能特点进行剖析。她们应用这套技术顺利地记录了蛙胸肌细胞中单一离子通道电压。结果显示,蛙胸肌细胞的细胞膜上一个离子通道可通过的电压约为2010-12A,换成离子数量大概是每秒通过一亿个离子。自此,她们又对离子通道的运作细胞膜片,细胞分泌过程及通道的调节功能进行了研究。A显示出玻璃微电极接触步入至细胞中。B则是使用中级放大仪,将膜上的离子通道与微量吸管的尖端相触,以放大一部份的细胞膜。其中,微量吸管内联接了电压放大器。D表示电压通过离子通道,离子通道开启。C为通道的高度放大:细胞外覆有受体以及离子滤膜。膜片钳技术是用玻璃微电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜,以吉欧姆(GΩ)以上的阻抗使之封接,使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域(膜片)与其周围在热学上绝缘,在此基础上固定电位,对此膜片上的离子通道的离子电压(pA级)进行检测记录的技巧。-logy----首先构建的单通道记录法(ng)是细胞吸附式(cell-),其后又完善了膜内面向外模式(-out)和膜外边向外(-out)的模式。
后来,又分别构建了开放细胞吸附内面向外模式(--)和穿孔囊泡外边向外模式(--)。全细胞记录法是指在常规的方式的基础上,附加穿孔膜片()的模式。膜片钳技术的最主要的优点在于阻抗封接产生的结果使露出电压很少,所以能正确地进行电流固定。但是不足的是,在产生巨阻抗封接时,因为腔内负压的作用使膜片被吸入微电极腔内,产生所谓的“Ω”形膜片,进而导致不可防止的机械性剌激。由巨阻抗封接带来的第二大优点是背底噪音水平达到极低。由于由热噪音造成甩尾的标准偏差与阻抗的平方根值成反比,所以巨阻抗封接是可达到最小。据悉,尽管所用的膜片钳放大器的探头场效应管运算放大器电流噪音较小,但对其也不能忽略。因为膜片微电极在安装时的阻抗性电压噪音与封接阻抗(Rs)成正比,故也可因巨阻抗封接而大大减少。在膜片钳技术出现之前,在电流固定条件下进行的细胞膜电压记录法,只能向细胞内刺入二根电极或则蔗糖和蜂蜡进行双重空隙法()从细胞外进行记录,但这两种方式仅适用于特别大的细胞。

相反地,应用膜片钳法时对通常较小细胞也能在电位固定的条件下记录出电压。这也是膜片钳法的一个很大的优点。据悉,膜片钳技术还有可以直接控制细胞内环境的优点,同时也存在相反的一面,即比较小的胞质中可动分子可被漏水,这又是它的不足之处。使影响膜通道诱因单一化:在同一细胞膜上通道的种类好多,可遭到如物理、电压和机械等多种诱因的影响而改变其机能状态。假如细胞在活动过程中,一直觉得地维持其膜电位不变,清不仅离子流的变化和膜电位变化之间的互相作用,可使观察诱因相对简单化。使参与活动的离子通道单一化:因为静息膜电位的水平可分别影响不同类型的离子通道,假如有意改变并维持某一膜电位水平,将使一类膜离子通道首先失活,清除这一类或几类通道的活动对实验结果的影响,再用一些特异性离子通道阻断剂后,就可观察剩余通道的活动规律。使参与活动的离子通道相对单一化。因为膜片钳技术的诞生,实现了对细胞膜少数几个或某一个离子通道的“开”“关”过程和活动规律的观察,并使研究个别诱因(如第二信使物质)对细胞膜通道膜内部份结构的作用成为可能。可任意的改变膜内外物资的组分,观察膜通道功能变化,为从分子水平研究细胞的活动机制提供有效的机能学技巧。
虽然膜片钳技术发展的历史不长,但因为它能区分通过细胞膜单个通道的电路,而多数实验都是以在特定细胞上抒发的单个离子通道的性质为研究对象,因而,已得到了广泛的应用,并已取得了许多重大的进展。通过膜片钳技术,人们才认识到膜私密性变化的本质,了解离子通道可有三种状态:开、关和失活。通道的开放是全或无式的,通道一旦打开产生的离子流幅值恒定,而只有开放时间长短的变化,因而通道开放的概率和开放的持续时间依赖于膜电位和时间。而配基门控通道有关掉、开放和脱敏三种状态,配基与受体的结合和解离的过程比较慢,通道开放态和关掉态的转换比较快,另外配基门控通道还受其他配基和乙酸化的调制。应用膜片钳技术可证明受体的存在并进行受体分型,即通过快速换液装置加相应的兴奋剂、拮抗剂及变构性调制剂,记录膜单通道的离子电压,并按照受体的动力学及其它特点来证明所要检查的受体。膜片钳技术扩充了电生理技术的应用范围,如往年因技术缘故无法研究喂奶植物的小细胞或延性很大的细胞,而今用膜片钳技术则可进行研究。膜片钳技术与Fura-2萤光测钙技术结合,一方面以萤光硬度检测细胞内Ca含量的变化,另一方面以全细胞膜片钳技术同时记录同一细胞膜电容的变化,从而剖析研究细胞内Ca含量与细胞分泌风波之间的关系。
膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链式反应技术结合,一方面可对形态相像的细胞作基因水平的鉴别,另一方面可对形态相像而电活动不同的细胞做出分子水平的解释。另外,膜片钳技术还可以阐明细胞内的信息传递、细胞生长过程,甚至包括中枢突触的复杂互相作用,相信不远的将来,这些技术在阐明生物活动奥秘中起着不可估量的作用。取材方式取材方式脑片脑片()()单细胞单细胞单细胞单细胞传代培养传代培养原代提取原代提取脑切块脑切块细胞打算细胞打算Patchclamp剖析中枢神经系统的命令交换与控制,离子通道的作用条件及机理。PatchclampPatchclamp--原理:硅硼玻璃制造的芯片对漂浮细胞进行钳制。芯片上有约1m的孔,从芯片外侧用泵施以负压使漂浮细胞被吸引到开孔处而产生封接。PatchClampRobotPatchClampRobot
