荧光（）是一种通过受激辐射发射的发光。 当特定波长的光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子从原来的轨道（基态）跃迁到更高能量的轨道（激发态）； 但激发态不稳定偏振光显微镜，电子会从激发态转变为基态，能量以光的形式释放，产生比原始激发光能量更低（波长更长）的荧光（图1）。 生物医学领域最常用的纯荧光光颜色是蓝色、绿色和红色，激发它们的颜色分别是紫外光、蓝光和绿光。 因此，大多数荧光显微镜至少配备三种滤光片：紫外线、蓝色和绿色。
要观察荧光发光，必须使用落射照明系统（图 2）。 光路与明场显微镜的投影照明不同。 光源发出的光首先穿过物镜并向相反方向发射，然后落在标本上激发荧光。 标本发出的荧光经物镜折射、放大，通过目镜按照传统光路进行观察。 在落射照明光路中，物镜实际上充当聚光镜。 对于切片的显微观察，必须首先使用白光进行投影照明来找到目标部位偏振光显微镜，然后关闭透射光源并打开落射照明。 由于需要高能量（小波长）激发光，荧光显微镜的光源通常采用高压汞灯或氙灯。
荧光显微镜成像虽然解决了背景干扰的问题，但在结构对比度和标本保存方面无法取代明场成像技术。 然而，在分子水平检测反应结果时，荧光显微镜观察点光源，定位精度比传统明场成像更高。 20世纪90年代以后，不同模式的超分辨显微镜无一例外地以荧光显微镜为基础而发展起来。
