对于菜鸟小白来说细胞膜教具图，免疫萤光染色可谓玄学，片子能不能染上，疗效又怎样，只能待到镜下检验。
明天丁香实验给你们整理了免疫萤光染色从「样本制备」到「问题剖析」的全流程，建议转发收藏！
对此大师弟建议菜鸟戳视频学习，原理、操作、常见问题剖析统统把握：点此查看操作视频
第一步
样本制做
以冰冻切块为例：首先将组织放在多聚甲醛固定过夜，30%蔗糖脱水后用包埋剂放在-20℃冷冻台上进行冰冻。
将冷藏好的组织块修平，根据不同的组织调整好预切长度，脑组织通常贴片长度为15-25um。切好的片子温度蒸熟后再进行后续染色处理。
点此查看冰冻切块实验
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不同的样本预处理方式不同，关于细胞样本制备：贴壁细胞样本基本原理是使细胞生长在合适的液相支持物玻片上，之后进行固定。
细胞样本的制备
细胞样本的制备
细胞样本的制备
第二步
萤光染色
按照一抗是否直接带萤光标记，将免疫萤光染色分为直接染色或间接染色。
直接染色法是携带萤光素的抗原直接与标本内的抗体反应，产生抗体—荧光素标记抗原复合物，该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。
实际上在实验室中，我们最常使用的还是间接染色法，先用特异性抗原与细胞内相应抗体结合，再用萤光素标记的二抗与特异性抗原相结合，产生抗体-特异性抗原-标记萤光抗原的复合物。
下边大师妹就以间接染色法为例展开表述：
实验步骤：
复温：取出制做好的样本（短期储存-20℃，常年储存-80℃保存），恢复至温度后细胞膜教具图，用1xPBS漂洗三次，每次5分钟；
抗体修补：用0.01M枸橼络合物缓冲液（pH6.0）充分曝晒样本，微波炉中低火加热修补，保持微沸状态5min疗效最好；
破膜：用0.5%X-100(1xPBS配制)温度通透20min（细胞膜上抒发的抗体省略此步骤）；
封闭：封闭液蛋白的选择原则是与一抗蛋白和目标蛋白种属不同，将非特异性位点结合掉，因而保证后续萤光染色的特异性。
一抗孵育：用抗原稀释液将一抗稀释成目标比列，4℃过夜。
一抗洗脱：第二天将湿盒掏出复温30min,用1xPBS洗脱三次，每次5min；
萤光二抗：用抗原稀释液稀释萤光二抗，温度孵育2h,注意避光;
二抗洗脱：用1xPBS洗脱三次，每次洗脱时间可稍长一些；
封片：用含防淬灭的甘油进行封片，按需可以对细胞核用DAPI进行染色；
胸片：蒸熟片子后，放在显微镜下观察，获取萤光图象。